Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass EGFR und EGFRvIII beide paradoxerweise puma basket beige mit proapoptotischen Proteinen koexprimieren und spezifisch mit PUMA in menschlichem GBM interagieren. Unter Verwendung einer Kohorte von 101 Gliomen und 12 normalen Hirngeweben untersuchten wir die Spiegel von EGFR / EGFRvIII und PUMA über IHC . Die Ergebnisse zeigen eine signifikante positive Korrelation zwischen den Expressionsniveaus von EGFR / EGFRvIII und PUMA (p = 0,039). Wie in 2a gezeigt, ist das Ausmaß der EGFR / EGFRvIII-PUMA-Coexpression bei hochgradigen / malignen Gliomen (20% bei AAs und 34,1% bei GBMs) signifikant höher als bei niedriggradigen Gliomen (6,3-7,7%). ) und normales Hirngewebe (0%).

U87MG-EGFR- und U87MG-EGFRvIII-stabile Transfektanten und T98G-GBM-Zellen mit endogenem EGFR wurden mit 1% DMSO und 1 & mgr; M Apoptose-induzierendem Staurosporin (ST) behandelt, geerntet und einer Immunpräzipitation / Western puma basket black Blot (linkes Feld) und Western Blot (rechts) unterzogen panel), wie bereits beschrieben. Es ist bekannt, dass sich PUMA auf den Mitochondrienmembranen befindet, um bei entsprechendem Stress eine Apoptose auszulösen [40; 41]. Begründet durch unsere Daten, die zeigen, dass EGFR und EGFRvIII PUMA puma basket bow gemeinsam exprimieren und interagieren und dass diese beiden Wege umgekehrt mit Apoptose verbunden sind, untersuchten wir, ob EGFR / EGFRvIII die subzelluläre PUMA-Lokalisierung regulieren könnte.

Daher analysierten wir die zytoplasmatische / mitochondriale Verteilung von PUMA im isogenen Paar von U87MG-EGFRvIII- und U87MG-Vektorzellen. Die Mitochondrienfraktionierung / Western-Blotting (5a) zeigte, dass PUMA in erster Linie in den nicht mitochondrialen Fraktionen von U87MG-EGFRvIII-Zellen unter nicht belasteten Bedingungen lokalisiert war und sich nach Exposition gegenüber den apoptotischen Induktoren Staurosporin (ST) und einer moderaten mitochondrialen Translokalisierung unterzog Anisomycin (AN). Wie puma basket classic damen durch den niedrigen mtPUMA-Index (0-0,02) angezeigt, ist der Großteil von PUMA in den nicht mitochondrialen Fraktionen der EGFRvIII-exprimierenden U87MGEGFRvIII-Zellen sequestriert (5a).

PUMA ist im Zytoplasma von EGFR- und EGFRvIII-exprimierenden GBM- und Brustkrebszellen unabhängig von apoptotischem Stress sequestriert. Das Ausmaß der mitochondrialen PUMA-Translokalisierung, mtPUMA-Index, wird wie unter Materialien und Methoden beschrieben berechnet. (A) PUMA ist hauptsächlich im Zytoplasma von U87MG-EGFRvIII-Zellen lokalisiert. Mit Vehikelkontrolle, Staurosporin (ST, 1 uM) oder Anisomycin (AN, 100 ng / ml) behandelte U87MG-EGFRvIII-Zellen wurden geerntet und in mitochondriale und nicht mitochondriale Fraktionen fraktioniert. Proteinextrakte aus beiden Fraktionen wurden einem Western Blot unterzogen, um PUMA, ±-Tubulin (cytoplasmatischer Marker) und Cox IV (mitochondriales Protein) nachzuweisen.

In Kontroll-siRNA-behandelten natürlichen T98G-GBM-Zellen ist PUMA hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. In EGFR-spezifischen siRNA-behandelten Zellen beobachteten wir einen deutlichen Anstieg des mitochondrialen PUMA (linkes Feld). EGFR-spezifische siRNA reduzierte wirksam die EGFR-Expression, wie durch die Western-Blots gezeigt (rechtes Feld). Lamin B: Kernprotein. ME: mitochondriale Extrakte. NME: nicht mitochondriale Extrakte. (D) PUMA wird puma basket grau im Zytoplasma EGFR-exprimierender menschlicher Brustkrebszellen sequestriert. MDA-MB-468-Zellen, von denen bekannt ist, dass sie hohe Mengen an endogenem EGFR exprimieren [34], wurden mit und ohne Staurosporin behandelt, in mitochondriale und nicht mitochondriale Fraktionen fraktioniert und Proteinextrakte wie zuvor beschrieben analysiert.

EGFR-spezifische siRNA reduzierte wirksam die EGFR-Expression, wie durch die Western-Blots gezeigt (5c-rechts). Zusätzlich zu GBM-Zellen fanden wir, dass PUMA im Zytoplasma von menschlichen MDA-MB-468-Brustkrebszellen lokalisiert ist (5d), von denen bekannt ist, dass sie signifikante Mengen von endogenem EGFR exprimieren [34]. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass PUMA im Zytoplasma von EGFR- und EGFRvIII-exprimierenden GBM- und Brustkrebszellen konstitutiv und unter apoptotischem Stress sequestriert wird.